Презентация Вершинской А.А.



  • ФГБУ «РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. Н.Н.БЛОХИНА» МИНЗДРАВА РОССИИ

    ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ ИНТЕГРИНЫ ПРИ СПОНТАННОМ ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНЕЗЕ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ СУХОГО ЭКСТРАКТА ФИТОАДАПТОГЕНА

    А.А. Вершинская

    2015

  • Из литературы известно, что снижение активности иммунных эффекторов в отношении опухолевых клеток cвязано в том числе как с ослаблением их адгезионных взаимодействий с клеточными мишенями, так и с нарушением цитокиновой регуляции. Изучение возможности восстановления регуляции адгезионных механизмов с участием сигнальной реактивности цитокинов при опухолевом процессе неспецифическими препаратами с адгезиогенным действием является перспективным.

  • В предыдущих исследованиях на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей высокораковой инбредной линии СВА было выявлено, что кратковременное (в течение первого месяца) и долговременное (с 6-ти месяцев на фоне возникших гепатом до естественной гибели) воздействие комплексного фитоадаптогена в форме жидкого экстракта приводит к усилению экспрессии лейкоцитарных интегринов на эффекторах иммунитета периферической крови. Оно сопровождается признаками лейкоцитарной инфильтрации и деструкции опухолевых узлов, а также подавлением сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10.

    Полученные результаты оказались существенными для снижения частоты спонтанного опухолеобразования на 30% (при обоих режимах введения препарата), увеличения средней продолжительности жизни при разных режимах применения на 15% и 30% соответственно.

  • Однако проведенные исследования оставили невыявленным фенотип клеток, инфильтрирующих опухоль, а также вопрос о том, экспрессированы ли на этих клетках, в частности, молекулы лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 при использовании комплексного фитоадаптогена. Также целесообразной является оценка роли гормонов, особенно стресс-гормона кортизола (кортикостерона у мышей) и полового гормона тестостерона, при столь существенном увеличении продолжительности жизни высокораковых животных. В связи с этим изучение влияния сухого экстракта как субстанции жидкого препарата фитоадаптогена на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей позволит с более высокой степенью объективности оценить результаты подавления опухолевого процесса и повышения продолжительности жизни животных.

  • Цель исследования:

     

    Изучение экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови и лейкоцитах, инфильтрирующих опухоль, при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена у высокораковых мышей линии СВА, а также значимости её коррекции при спонтанном гепатоканцерогенезе

  • Задачи исследования:

    1.Исследование экспрессии лейкоцитарных интегринов на клетках периферической крови у мышей-самцов инбредной линии СВА с высокой частотой спонтанного опухолеобразования при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в онтогенезе.

    2.Оценка влияния сухого экстракта фитоадаптогена на сывороточный уровень ИЛ-6 и ИЛ-10 у высокораковых мышей.

    3.Определение воздействия сухого экстракта на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином у мышей-самцов линии СВА.

    4.Морфологическое исследование ткани печени высокораковых мышей при разных режимах применения сухого экстракта фитоадаптогена.

    5.Иммунофенотипирование опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов в ткани печени высокораковых мышей, получавших сухой экстракт фитоадаптогена в разных режимах.

    6.Исследование воздействия сухого экстракта фитоадаптогена на концентрацию тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови мышей высокораковой линии СВА.

    7.Изучение воздействия сухой формы препарата на продолжительность и качество жизни мышей с высокой частотой спонтанного опухолеобразования.

  • МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Иммунологические (РИФ, ИФА)

    Иммуногистохимические (с АТ, меч. пероксидазой)

    Морфологические

    Статистические (“STATISTICA” 6.0 с помощью однофакторного дисперсионного анализа ONE–WAY ANOVA, метод множительной оценки Каплан-Мейера)

    В работе использовано 300 мышей-самцов линии СВА (сублиния СВА/Lac Y)

     

    Эта линия является классической моделью генетической предрасположенности к опухолям печени с высоким риском их возникновения. Первые спонтанные гепатомы у мышей-самцов линии СВА возникают, начиная с 6-месячного возраста, и встречаются в 7 раз чаще, чем у самок [Медведев Н.Н. 1964; Sharp J. et al., 1976]. В позднем онтогенезе, в возрасте 18-22 месяца, в 100% случаев у самцов выявляют гепатокарциномы [Фактор В.М. и др., 1984; Sharp J. et al., 1976].

    Мыши контрольной группы получали в качестве питья только воду. Мыши группы 2 получали 0,3% водный раствор сухого экстракта, начиная с рождения до возраста 1 мес постнатального развития. Мыши группы 3 получали аналогичный раствор, начиная с возраста 6 мес (время появления первых опухолей) курсами, до естественной гибели животного. Курс применения препарата составил 3 недели, интервал между курсами – 1 неделю. Доза сухого экстракта была приведена в соответствие с эффективной дозой жидкого экстракта фм-40, которая была выбрана на основании предыдущих исследований.

  • Комплексный фитоадаптоген (фитомикс-40 сухой экстракт)

     

    содержит вещества из экстрактов сорока растений, в том числе адаптогенов (флавоноиды, полифенолы, гинзенозиды, аралозиды, схизандрин, салидрозид, элеутерозиды и др.) Препарат стандартизован, сертифицирован в качестве парафармацевтика. В работе использовали порошок, полученный при высушивании жидкой формы комплексного фитоадаптогена по определённой технологии.

  • Уровень экспрессии CD11a антигена лимфоцитами периферической крови мышей СВА при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена

    Результаты работы показали, что у мышей-самцов в возрасте 4-х и 8-ми мес число клеток крови, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин LFA-1, или CD11a в контрольной группе, практически одинаково. В возрасте 22 мес этот показатель у животных достоверно снижается.

    У мышей, которым в течение первого месяца жизни, захватывая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени, с питьевой водой вводили фитоадаптоген (группа 2), изучаемый показатель к 22-м месяцам снижается не значимо.

    Введение препарата, начиная с шестимесячного возраста постнатального онтогенеза (группа 3), к 22-м мес выявило также достоверное повышение данного показателя в сравнении с контролем.

  • Уровень экспрессии CD11b антигена лимфоцитами периферической крови мышей СВА при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена

    Также было показано, что в контрольной группе количество мононуклеаров крови мышей линии СВА, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин Mac-1, или CD11b, в онтогенезе к возрасту 22-х месяцев достоверно подавляется.

    У опытных мышей 2-й группы изучаемый показатель в позднем онтогенезе достоверно отставал в своем снижении от уровня контроля в этом возрасте.

    В 3-ей группе в позднем онтогенезе параметр также статистически значимо превышал цифру в группе контроля.

  • Изменение уровня интерлейкина-6 в сыворотке крови мышей СВА при применении сухого экстракта фитоадаптогена

    Вместе с тем в 1-й группе у контрольных животных концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови к 22-х месячному возрасту достоверно возрастает.

    У опытных мышей 2-й группы сывороточный уровень ИЛ-6 к 22-х месячному возрасту достоверно возрос, отставая в своём значении от контрольной группы в позднем онтогенезе статистически значимо.

    В 3-ей группе животных содержание сывороточного ИЛ-6 к 22 мес также повышается, достоверно не достигая контрольных значений в этом возрасте.

  • Изменение уровня интерлейкина-10 в сыворотке крови мышей СВА при применении сухого экстракта фитоадаптогена

    Кроме того, выявлено, что сывороточная концентрация ИЛ-10 у контрольных животных в постнатальном онтогенезе растет. В возрасте 22 мес показатель ИЛ-10 достоверно превышал значения в более ранние периоды.

    У опытных мышей во 2-й группе содержание ИЛ-10 в позднем онтогенезе увеличивается в меньшей степени и достоверно не достигает контрольных значений.

    У мышей 3-ей группы при долговременном применении препарата с 6-ти месячного возраста динамика показателя ИЛ-10 аналогична таковой для 2-й группы. Выявлено, что содержание ИЛ-10 к возрасту 22 мес достоверно отстаёт от контрольного уровня. Таким образом, применение комплексного фитоадаптогена в форме сухого экстракта на фоне возникающих спонтанных опухолей также может способствовать подавлению сывороточной концентрации ИЛ-10.

  • Изменение частоты возникновения спонтанных гепатом у мышей-самцов линии СВА в возрасте 22 месяца под воздействием сухого экстракта комплексного фитоадаптогена

    Здесь следует отметить, что в контрольной группе мышей в возрасте 22 мес опухоли выявлены у всех животных, т.е. частота возникновения опухолей составляет 100%. Число опухолей на мышь составило 2,8 ± 0,5.

    У животных опытной группы 2 опухоли возникали реже - в 66,7% случаев. При этом количество гепатом на мышь достоверно ниже, чем в контроле - 1,5± 0,4.

    В 3-й группе животных, которым вводили препарат с шестимесячного возраста постнатального онтогенеза, как частота возникновения гепатом (72,7%), так и число опухолей у одного животного (1,6 ± 0,2) сравнимо с показателями 2-й опытной группой мышей.

  • Размеры спонтанных гепатом у мышей-самцов линии СВА в возрасте 22 месяца под воздействием сухого экстракта комплексного фитоадаптогена

    Средний объём одной опухоли у контрольных животных был равен 400 мм3. При этом величина опухолевой массы в среднем у одного животного равна 1100 мм3.

    Во 2-й группе средний объем опухолевого узла 260 мм3 не имел достоверных отличий от контроля (р=0,35). В то же время общий объём опухолевой массы у одного животного оказался значимо меньше — 380 мм3. В 3-ей группе как объём одиночной опухоли (66), так и общий объём опухолевой массы (90) снизился по сравнению с контролем достоверно.

  • Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки у самца линии СВА контрольной группы в возрасте 22 мес (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400)

    Представлена низкодифференцированная трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома, т.е. опухоль смешанного строения, которые мы наблюдали в возрасте 22 мес в печени у высокораковых мышей-самцов линии СВА в контроле.

  • Печень самца линии СВА группы 3 в возрасте 22 месяца (увеличение х 400, окраска гематоксилином и эозином)

    Для сравнения можно привести участок нормальной ткани печени мышей СВА в этом возрасте.

  • Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки, инфильтрированная лимфоцитами. Самец линии СВА в возрасте 22 мес 2-й группы (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400)

    На этом рис. представлена гепатокарцинома такого же строения, как и в контроле, мышей линии СВА в возрасте 22-х мес, принимавших сухой экстракт ФМ-40 в течение первого месяца постнатального онтогенеза. Видно, что в данном случае гепатокарцинома инфильтрирована массой лимфоцитов. Также наблюдается деструкция опухоли.

  • Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома, инфильтрированная лимфоцитами. Самец линии мышей СВА в возрасте 22 мес 3 группы (окраска гематоксилином и эозином, увеличение × 400)

    Далее продемонстрирована опухоль печени мышей линии СВА в возрасте 22-х мес, принимавших сухой экстракт с шестимесячного возраста постнатального онтогенеза. Здесь также наблюдается инфильтрация гепатокарциномы лимфоцитами и деструктивные процессы в опухоли.

  • Здесь представлена иммуногистохимическая реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца СВА 2-й группы в возрасте 22 мес:

    а – положительная реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах

    б – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами

  • На данном слайде представлена иммуногистохимическая реакция с CD11a антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 2 группы в возрасте 22 мес.

    а – положительная реакция с CD11a-антигеном на лимфоцитах

    б – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами

  • На этом слайде показана иммуногистохимическая реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 2 группы в возрасте 22 мес:

    а – положительная реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах

    б – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами

  • Здесь показана иммуногистохимическая реакция с CD8 антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес

    а – положительная реакция с CD8a антигеном на лимфоцитах

    б – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами

  • На этом слайде представлена иммуногистохимическая реакция с CD11a антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес.

    а – положительная реакция с CD11a антигеном на лимфоцитах

    б – контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами

  • Также здесь представлена иммуногистохимическая реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах, инфильтрирующих трабекулярно-ацинарную гепатокарциному, самца линии мышей СВА 3 группы в возрасте 22 мес

    a - положительная реакция с CD11b антигеном на лимфоцитах

    б - контрольный срез, не покрытый моноклональными антителами

  • Следовательно, можно полагать, что мигрирующие в опухоль цитотоксические CD8+ лимфоциты экспрессируют на своей поверхности молекулы гетеропитической адгезии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, что согласуется с подавлением образования гепатокарцином в опытных группах.

  • На данном рис. показаны кривые выживаемости мышей-самцов линии СВА, построенные по методу Каплан-Мейера, при разных схемах введения комплексного фитоадаптогена

  • Здесь представлена выживаемость высокораковых мышей линии СВА при разных схемах введения сухого экстракта комплексного фитоадаптогена

  • При этом средняя продолжительность жизни мышей в контроле, т.е. при спонтанном гепатоканцерогенезе составила 665 дней (22,0 мес). При введении комплексного фитоадаптогена в течение первого месяца постнатального онтогенеза, примерно, за пять месяцев до возникновения гепатом, выживаемость животных увеличилась до 779 дней (25,6 мес). Таким образом, разница в выживаемости мышей между первой и второй группой оказалась 114 дней (3,5 мес). Этот же показатель в группе 3 оказался 812 дней (26,6 мес). Следовательно, мыши 3 группы жили дольше животных контрольной группы на 4,5 месяца.

    При этом медиана выживаемости животных увеличилась во 2 группе по сравнению с контролем примерно на 5 мес, а в 3 - на 6 мес.

  • Мы посчитали количество мышей, которые жили более 1000 дней. В 1 группе их не было, во 2 группе - 1 самец, в 3 группе - 7 мышей. Их средняя продолжительность жизни составила 1076 дней. Рекордсменами были 2 самца, прожившие 36 месяцев – то есть 3 года. В пересчете на человеческие годы эти мыши жили 102 года. При этом контрольные мыши в пересчете на людей прожили около 62 лет. У двух самцов-долгожителей выявили по одной опухоли объёмом 260 и 28 мм,3.

    В общем, получены результаты увеличения продолжительности жизни у высокораковых самцов на 17% в группе 2 и на 22% в группе 3.

  • Состояние шерстного покрова мышей СВА контрольной и опытных групп в позднем онтогенезе (в возрасте 22 мес)

  • При оценке соматического состояния не у всех контрольных животных вид шёрстного покрова в возрасте 22 мес был полноценным: у 20% животных констатировали седую шерсть и признаки алопеции. Все экспериментальные животные 2 и 3 групп в возрасте 22 мес и старше были покрыты практически полноценным шёрстным покровом без алопеций. Полноценный шерстный покров мышей опытных групп сочетается со снижением сывороточного уровня ИЛ-6. Последнее может препятствовать потере шерсти в результате стимуляции функциональной активности волосяных фолликулов при подавлении воспалительного процесса в кожном покрове.

  • Внешний вид самца контрольной группы в возрасте 23 мес.

  • Внешний вид опытного самца 2 группы в возрасте 33 мес.

  • Внешний вид опытного самца 3 группы в возрасте 36 мес.

  • Вес мышей высокораковой линии СВА контрольной и опытных групп в разные периоды онтогенеза

  • Контрольное взвешивание показало, что в 4 мес масса животных во всех группах примерно одинакова, к 8 месяцам она достоверно увеличивается. В позднем онтогенезе средний вес животных в контроле снижается, а в опытных группах остается почти на уровне возраста 8 мес. Последнее сочетается с подавлением сывороточного уровня ИЛ-6 и -10, которые могут негативно регулировать патогенез кахексии животных, снижая сывороточный уровень С-реактивного белка и предотвращая при этом расщепление мышечных белков.

  • Результаты воздействия сухого экстракта фитомикса-40 на концентрацию тестостерона в сыворотке крови у мышей высокораковой линии CВА

  • Результаты воздействия сухого экстракта фитомикса-40 на концентрацию кортикостерона в сыворотке крови у мышей высокораковой линии CВА

  • Также в результате работы было выявлено, что уровень тестостерона в онтогенезе контрольных мышей-самцов достоверно падает. В опытных группах снижение этого гормона с возрастом значимо отстаёт от контроля.

    Стресс-гормон кортикостерон (который, как известно, вызывает, в частности, апоптоз лимфоцитов) достоверно возрастал с увеличением возраста у контрольных животных. В опытных группах увеличение уровня этого гормона значимо отставало от контроля.

    Применение сухого экстракта оказало гормономодулирующий эффект: в отношении анаболического тестостерона предотвращало в определенной мере его снижение, а в отношении катаболического кортикостерона — его повышение. Гормономодулирующее воздействие сопровождается повышением иммунореактивности, подавлением частоты образования гепатокарцином, повышением продолжительности и качества жизни, что можно расценивать как геропротекторный эффект. Последний может быть связан как с противоопухолевым влиянием препарата, с регуляцией механизмов старения, так и с тем и другим одновременно.

  • Таким образом, коррекция лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на иммунных эффекторах периферической крови, которая может обеспечиваться снижением сывороточного уровня ИЛ-6, ИЛ-10, способствовать инфильтрации опухоли цитотоксическими CD8+лимфоцитами, обеспечивающими контактные взаимодействия эффекторов иммунитета с опухолевыми клетками, при участии молекул гетеротипической адгезии LFA-1 и Mac-1. Эти события сочетаются с ростом уровня тестостерона, снижением — кортикостерона, а также с повышением продолжительности и качества жизни высокораковых мышей.

  • ВЫВОДЫ

    1.При воздействии сухой формы комплексного фитоадаптогена в раннем постнатальном онтогенезе в течение первого месяца жизни, включая завершающий период дифференцировки ткани печени), а также начиная с 6 мес до естественной гибели животного) режимах высокогепатомным мышам-самцам линии СВА происходит долговременное повышение экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови.

    2.Применение комплексного фитоадаптогена в сухой форме выявило долговременное снижение сывороточного содержания ИЛ-6 и ИЛ-10.

    3.Введение сухого экстракта фитоадаптогена привело к снижению частоты возникновения наследственных гепатом, а также уменьшению числа опухолей и объема опухолевой массы у одного животного.

    4.При воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена у мышей СВА микроскопические и иммуногистохимические исследования выявили инфильтрацию трабекулярных и трабекулярно-ацинарных гепатокарцином умеренной и низкой дифференцировки цитотоксическими CD8+, CD11a+, и CD11b+ лимфоцитами, а также элементы деструкции опухолей.

    5.Увеличение продолжительности жизни у высокораковых мышей-самцов СВА на 17% при использовании в раннем постнатальном онтогенезе и на 22% при длительном применении сухого экстракта комплексного фитоадаптогена, сочетается с повышением в онтогенезе гормона тестостерона и подавлением стресс-гормона кортикостерона.

    6.Повышение выживаемости животных под влиянием сухой формы комплексного фитоадаптогена выявлено вместе с хорошим соматическим состоянием мышей обеих опытных групп, которое характеризовали удовлетворительным шёрстным покровом без алопеций и потери веса в отличие от контрольных животных.