Презентация Карповой Р.В.



  • Разработка и обоснование способа определения биологической активности фитоадаптогенов на модели одноклеточных эукариот

    • При разработке методов биологического контроля и стандартизации фитоадаптогенных препаратов необходимо учитывать их способность нормализовать биологические реакции при изменившихся внешних условиях.

     

    • Практикуемые в научных исследованиях методы заключаются в изучении влияния адаптогенов на показатели физической выносливости животных, в оценке их стресс-протекторной, гонадотропной и антидиуретической активности. Однако их применение в условиях производства ограничивается трудоемкостью, необходимостью испытания на животных, сложностью объективной оценки эффекта.

     

    • Неоднократно предпринимались попытки разработать более доступные способы биологического контроля фитоадаптогенов in vitro. Однако они не доведены до количественной реализации.

     

    • В данном исследовании в качестве тест-объекта для количественного биологического контроля фитоадаптогенов использовали отобранный в результате предварительного скрининга штамм дрожжей S.cerevisiae.

  • Мы предложили градуировать активность адаптогенов по уровню пролиферации медленно растущих клеток дрожжей. Замедление роста возможно, в частности, при замене в среде глюкозы, которая усваивается непосредственно по пути гликолиза и обеспечивает наибольшие скорости роста на этанол. В этом случае дрожжевая клетка аэробно преобразует этанол и синтезирует углеводы через реакции глюконеогенеза. На этот процесс затрачивается дополнительное время, следствием чего является снижение скорости роста культуры. Поскольку адаптогены активизируют обменные процессы в случае их замедления, можно ожидать, что их добавление в среду с этанолом приведет к ускорению роста дрожжей, и рассматривать этот фактор как характеристику биологической активности препаратов. В работе изучали различные препараты женьшеня и родиолы розовой из природного сырья, из биомассы культуры тканей этих растений, а также комплексные фитоадаптогены.

  • В работе изучали различные препараты женьшеня и родиолы розовой из природного сырья, из биомассы культуры тканей этих растений, а также комплексные фитоадаптогены.

    В ходе исследований подтверждено, что наиболее активный рост клеток дрожжей достигается в положительном контроле - полной среде с глюкозой. Замена глюкозы на этанол в отрицательном контроле приводит к снижению скорости роста клеток.

    Влияние различных доз биоженьшеня на рост культуры дрожжей

    +К – полная среда с глюкозой; -К – полная среда с этанолом; 1- содержание СГФ 8 мкг/мл; 2 – 20мкг/мл; 3 – 40мкг/мл; 4 – 80 мкг/мл

  • В то же время, введенный в среду культивирования с этанолом биоженьшень дозозависимо ускоряет рост дрожжевой культуры.

    Функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания СГФ в среде с этанолом

    Препарат биоженьшеня

     

     (СГФ = 0,2%)

     
    Y=a+b√Apan

     

    Ip=1,86+0,572√Apan

     

    (ip-1,86)

    Apan = -------------------100%

    0,327 KkkV (мкл)

  • Применив математический подход, мы выявили, что функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания в среде СГФ препарата биоженьшеня на 4-й час культивирования представляет собой обратную параболу, описываемую уравнением, представленная ниже:

    у = а + bАpan

     

     

    у - индекс пролиферации клеток дрожжей в пробе с биоженьшенем;

    А – абсолютное содержание СГФ в объеме препарата, введенного в среду с этанолом, выраженное в мг;

    а - 1,86 – индекс пролиферации клеток в отрицательном контроле.

    На основании большого экспериментального материала методом нелинейной регрессии определено значение коэффициента b для препаратов биоженьшеня (0,572).

    В результате проведенных математических преобразований получена итоговая формула, позволяющая количественно (в %) определять содержание СГФ в препаратах биоженьшеня биологическим способом (формула). В формуле учитываются индексы пролиферации клеток дрожжей в положительном и отрицательном контроле, объем внесенного адаптогена и коэффициент качества культуры.

  • Для препаратов биородиолы была выявлена аналогичная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания в среде фенольных соединений, но с другим значением коэффициента b при радикале (0,490). Формула для количественного определения фенольных соединений представлена на рисунке (формула).

    Функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания ФС в среде с этанолом

    Препарат биородиолы

     

    (ФС=0,2%);

     

    Ip= 1,86 + 0,486√Аrhod;

     

    (ip-1,86)

    Arhod = ------------------100%

    0,24 Kkk V (мкл)

  • Необходимо было оценить насколько корректны полученные формулы для препаратов из природного сырья. Определено, что характер зависимости, а также коэффициенты в формулах для натурального женьшеня (кривая 1) и натуральной родиолы розовой (кривая 2) совпадают с таковыми для биопрепаратов.

    Зависимости индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания биологически активных веществ препаратов из природного сырья

    1 – СГФ (препарат женьшеня)

    Ip=1,86+0,570√Apan
     

    2 – ФС

    (препарат радиолы розовой)

    Ip= 1,86 + 0,490√Аrhod

    Итак, характер зависимости индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания биологически активных веществ препарата фитоадаптогена, а также величина коэффициента при радикале в формуле являются индивидуальной характеристикой конкретного адаптогена независимо от источника сырья.

    Используя значение индекса пролиферации клеток дрожжей в среде с адаптогеном на 4-й час культивирования и выведенные формулы можно определить содержание БАВ в данных препаратах.

  • Для доказательства специфичности метода исследовано влияние возрастающих концентраций глюкозы в полной среде с этанолом на рост клеток дрожжей. В этом случае, когда усвоение глюкозы идет по эффективному пути гликолиза, зависимость индекса пролиферации от содержания в среде глюкозы имеет вид не обратной параболы, как в предыдущих экспериментах, а кривой насыщения.

    Зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей S.cerevisiae от концентрации глюкозы в среде с этанолом

    K1*C

    Ip= --------------- , где

    K2+C

    К1 = 2,62; К2 = 0,05

  • Однако изложенный выше способ оценки активности, выраженной в процентном содержании БАВ для конкретного адаптогена, не позволяет сравнивать различные препараты, например женьшеня и родиолы розовой между собой.

    Сравнение активностей биопрепаратов женьшеня и родиолы розовой

     

    r = + 0,68 ± 0,12

     

  • Критерием сравнения различных фитоадаптогенов явилась величина относительной адаптогенной активности, вычисляемая по формуле, представленная ниже.

    Разницу между индексами пролиферации при максимальном и минимальном росте приняли за 100% или за 1 условную единицу адаптогенности.

    Эта величина показывает насколько препарат способен повысить рост клеток в неблагоприятных условиях, каковыми в данных экспериментах являлось культивирование дрожжей в энергетически бедной среде с этанолом.

    Принимая за максимум в выбранных условиях культивирования рост дрожжей на среде с глюкозой, за минимум – рост на среде с этанолом, относительную адаптогенную активность препарата определяем как меру повышения адаптогеном индекса пролиферации клеток дрожжей в среде с этанолом относительно положительного контроля.

    Величина относительной адаптогенной активности

    Ip (exp) - Ip (-K)

    P= --------------------- х 100%

    Ip (exp) - Ip (+K)

    Содержание специфических веществ препаратов, определенное химическим и биологическим (по выведенным формулам) способами совпадает и коррелирует с показателем их адаптогенной активности.

  • Также получена положительная корреляция между относительной адаптогенной активностью изучаемых монопрепаратов на модели дрожжей и их иммуномодулирующей активностью in vivo.

    Иммуномодулирующую активность препаратов определяли по их способности восстанавливать бласттрансформацию Т-лимфоцитов селезенки мышей на фоне иммунодепрессии, вызванной введением дексаметозона.

    Наиболее активным оказался препарат родиолы розовой из природного сырья. Он имел самые высокие показатели адаптогенной и иммуномодулирующей активности, что сопоставимо с высоким содержанием фенольных соединений. Наименьшие адаптогенную и иммуномодулирующую активности показал препарат натурального женьшеня, имеющий низкое содержание СГФ. Биоженьшень и биородиола занимали промежуточное положение по этим параметрам.

    Представленные выше результаты послужили основанием для определение биологической активности Фитомикса-40. В качестве препарата сравнения использовали одну из фитокомпозиций, полученную при отборе оптимального состава препарата.

    Сравнение препаратов женьшеня и родиолы розовой по адаптогенной и иммуномодулирующей активности

  • Зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей от концентрации препарата сравнения в среде инкубации также является обратной параболой. Коэффициент b при радикале равен 1,0.

    Функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей S.cerevisiae от содержания фитомикстуры сравнения в среде с этанолом

  • На данном рисунке представлена аналогичная зависимость для Фитомикс-40. Формула, описывающая ее, отличается только значением коэффициента b.

    Функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей S. cerevisiae от содержания Фитомикс-40 в среде с этанолом

  • Характер полученных кривых идентичен таковому для исследуемых ранее препаратов отдельных адаптогенов, что может служить доказательством адаптогенных свойств Фитомикс-40 и препарата сравнения.

  • В то же время комплексные фитомикстуры различаются между собой по соотношению компонентов. Это отражено в различии величины коэффициента при радикале в формуле.

    Показано, что комплексные препараты более активны индивидуальных фитоадаптогенов. При этом Фитомикс-40, имеющий оптимальный сбалансированный состав, наиболее активен.

    Сравнение моно- и комплексных препаратов по относительной адаптогенной активности

  • Определение биологической активности не исключает химического контроля фитоадаптогенов. В настоящее время изучаются ведущие группы веществ Фитомикса-40 и препарата сравнения.

    Таким образом, в результате исследования разработан количественный способ определения адаптогенной активности растительных препаратов. Он может быть применен как один из тестов в системе предварительного скрининга нетоксических иммуномодуляторов, а также для контроля и стандартизации активности индивидуальных и комплексных фитоадаптогенов на производстве. Вместе с тем он позволит фармакологически корректно устанавливать дозы при использовании таких препаратов в клинической практике. Особенную ценность разработанный способ может иметь в случае поиска и скрининга новых адаптогенов, в том числе комплексных препаратов, для которых еще не разработаны методы химического определения БАВ. Приоритет и новизна предлагаемого способа защищены патентом РФ.