Презентация Лыженковой М.А.




  • Критерии разработки состава комплексного фитоадатогена

    Фитомикс - 40

    • Повышение эффективности лечения онкологических больных является актуальной проблемой. Одним из перспективных направлений профилактики опухолевых заболеваний на сегодняшний день является разработка новых фитокомплексных препаратов.

     
    • Ранее накоплен богатый материал, свидетельствующий о лечебных и профилактических свойствах моноадаптогенов (экстрактов женьшеня, элеутерококка, родиолы розовой и т.д.).

    • Установлено, что введение монопрепаратов отодвигало сроки развития спонтанных и индуцированных опухолей, снижало скорость их роста и частоту возникновения, а также увеличивало продолжительность жизни животных.

    • Включение этих препаратов в схемы химиотерапии значительно повышало ее эффективность.

    • Применение моноадаптогенов в клинике на фоне специфического лечения, а также у неоперабельных больных снижало уровень метастазирования, увеличивало безрецидивный период, улучшало качество их жизни.

  • Показано, что действие адаптогенов на организм опосредуется в том числе через иммунологические механизмы. Так, выявлен интерфероногенный эффект адаптогенов, установлено повышение активности натуральных киллеров как системы естественной резистентности организма, усиление активности Т-клеточного звена иммунитета. Вместе с тем под влиянием адаптогенов на поверхности опухолевых клеток усиливается экспрессия молекул адгезии, являющихся лигандами иммунных эффекторов, что может приводить к стимуляции иммунологической реактивности организма онкологического больного. Однако использование моноадаптогенов ограничено индивидуальной чувствительностью пациентов, и требует систематического иммунологического контроля. Кроме того, ранее не были разработаны критерии стандартизации препаратов в соответствии с их биологической активностью.


  • C целью преодоления индивидуальной чувствительности к монопрепаратам перспективным направлением является создание комплексного растительного препарата

     

    Цель исследования:


    Создание стандартизованного адаптогенного комплекса растительных экстрактов для профилактической онкологии, обладающего иммуномодулирующим действием

  • Задачи исследования

    1.Изучение влияния отдельных растительных экстрактов и их композиций на пролиферативную активность культуры опухолевых клеток человека, выбор наиболее перспективных фитокомпозиций.

    2.Исследование воздействия выбранных композиций на иммунологический фенотип лимфоцитов больных III-IV стадий с опухолями различных локализаций in vitro.


    3.Изучение влияния комплексных растительных препаратов на интерфероногенез клеток крови онкологических больных III-IV стадий с опухолями различных локализаций in vitro.

    4.Оценка адаптогенной активности фитомикстур на основании изучения функциональной зависимости индекса пролиферации клеток пекарских дрожжей Saccharomyces сerevisiae от содержания фитокомпозиций в среде на 4-ый час культивирования, выбор наиболее перспективной фитомикстуры (ФМ).

  • ПОДБОР СОСТАВА ПРЕПАРАТА ФИТОМИКС-40 НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ

  • На первом этапе нами было исследовано 46 растительных экстрактов. Подбор экстрактов-составляющих комплексного фитоадаптогена провели с учетом воздействия каждого экстракта в отдельности на пролиферативную активность культуры клеток карциномы яичников человека (CaOv).

    У 36 из изученных экстрактов была выявлена обратная корреляция между концентрацией препарата в среде инкубации и уровнем включения 3Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток (экстракты травы раст. cем. Hypericaceae, корней раст. сем. Araliaseae, листьев раст. сем. Vacciniaceae). На следующем слайде в качестве примера приведена зависимость уровня включения 3Н-тимидина в ДНК трансформированных клеток от концентрации экстракта растения сем. Papaveraceae в среде инкубации.

     
  • Зависимость уровня включения 3Н-тимидина в ДНК клеток карциномы яичников от концентрации экстракта растения сем. Papaveraceae в среде инкубации

  • Для 10 растительных экстрактов изменение концентрации препарата в среде инкубации не влияло на клеточную пролиферацию (экстракты плодов растения сем. Caprifoliaceae, травы растения сем. Plantaginaceae, плодов растения сем. Umbellifera и др.). Соответствующий пример для экстрактов травы растения сем. Asteraceae показаны на слайде.

    Зависимость уровня включения 3Н-тимидина в ДНК клеток карциномы яичников от концентрации экстракта листьев растения сем. Asteraceae в среде инкубации

  •  

    Далее исследуемые нами экстракты были охарактеризованы по эффективности подавления пролиферации клеточной культуры. В качестве критерия антипролиферативного эффекта использовали показатель СЕ50. Пороговой дозой была концентрация 100 мкг/мл. В соответствии с этим шесть из полученных экстрактов можно отнести к препаратам с умеренным антипролиферативным эффектом, поскольку их СЕ50 занимал интервал от 70 до 100 мкг/мл (экстракт травы растений сем. Papaveraceae, Equisetaceae, цветков растения сем. Asteraceae). Остальные оценены как препараты без антипролиферативного эффекта: экстракт корней растения сем. Crassulaceae, растения сем. Lamiaceae, плодов растения сем. Rosaceae.

  • Показатель антипролиферативного эффекта СЕ50 некоторых изученных растительных экстрактов относительно клеток аденокарциномы яичников человека (линия CaOv)

  • На основании проведенных экспериментов, а также учитывая технологическую адекватность ингредиентов и отсутствие химического взаимодействия между компонентами, часть растительных экстрактов была отброшена.

    На следующем этапе работы было составлено 7 вариантов фитомикстуры. Каждый из вариантов включал 40 растительных экстрактов, отобранных на основании предыдущих исследований. Для этого все ингредиенты были условно разделены на 3 группы. В группу А вошли экстракты растений, обладающих адаптогенным действием (корни и корневища растений сем. Araliaceae, Crassulaceae и др.) В группу В вошли растительные экстракты, являющиеся источниками витаминов (из плодов растения сем. Rosaceae, Vacciniaceae, Saxifragaceae и др.). В группу С вошли экстракты растений, обладающих моче- и желчегонным и седативным действием (листья растения сем. Myrtaceae, растения сем. Valerianaceae, почки раст. сем. Pinaceae, плоды растения сем. Umbelliferaе).

     
  • Составы изучаемых вариантов фитомикстуры в пересчете на объемные проценты относительно включаемых групп экстрактов (А, В, С)

  • Исследования, проведенные на культуре клеток карциномы яичников человека (линия CaOv), показали, что изучаемые варианты фитомикстуры обладают разным воздействием на пролиферативную активность опухолевых клеток. Варианты №1, 2, 3 и 7 достоверно снижали включение 3Н-тимидина в ДНК клеток культуры CaOv. Варианты №4, 5 и 6 не влияли на клеточную пролиферацию.

     
  • Зависимость уровня включения 3Н-тимидина в ДНК клеток культуры CaOv от содержания фитомикстуры №1 в среде инкубации

  • Зависимость уровня включения 3Н-тимидина в ДНК клеток культуры CaOv от содержания фитомикстуры №7 в среде инкубации

  •  

    Наиболее эффективно подавляли рост опухолевых клеток в культуре варианты фитомикстуры №1 и №7.

    Именно они были выбраны нами для дальнейшего исследования.

     
  • Последующие эксперименты позволили оценить влияние выбранных композиций на иммунологические параметры. В работе использовали кровь онкологических больных 3-4 стадий с опухолями различных локализаций. В таблице приведены объединенные данные по всем группам исследованных больных, поскольку достоверных специфических отличий в группах получено не было. Инкубированиие in vitro лимфоцитов онкологических больных с комплексными фитомикстурами показало, что препараты не нарушают экспрессию дифференцировочных антигенов на клеточной поверхности.

    Влияние фитокомпозиции №1 на экспрессию дифференцировочных антигенов онкологических больных (31 человек) in vitro

  • Отмечена положительная динамика показателей иммунного статуса: рост хелперно-супрессорного соотношения, улучшение показателей естественной резистентности, Т- и В- клеточного звена иммунитета, выявлено повышение экспрессии молекул адгезии. При этом во всех описанных эффектах преимущество имеет ФМ №7.


    Влияние фитокомпозиции №7 на экспрессию дифференцировочных антигенов онкологических больных (31 человек) in vitro

  •  

    Принимая во внимание известный из литературы неспецифический интерфероногенный эффект отдельных адаптогенов, в работе провели исследование влияния на интерфероногенез лимфоцитов фитокомпозиций №1 и 7 в сравнении с известными препаратами – индукторами ИФН. Результаты оценивали по титру ИФН, защищающему 50% клеток монослоя диплоидных фибробластов человека при воздействии вируса болезни Ньюкасла. Все изученные препараты индуцируют выработку ИФН клетками крови онкологических больных. Под влиянием индукторов ИФН показатель титра возрастает в среднем в 15 раз относительно контрольных значений. Максимальную активность имеет амиксин. В тоже время ФМ повышают уровень эндогенного ИФН в среднем в 30 раз. При этом показатель титра, индуцированного фитомикстурой ФМ №7 выше относительно ФМ №1.

  • Влияние различных препаратов на индукцию интерфероногенеза

    * - значения представлены в виде log2 (титр-1)

  • Также было проведено сравнительное изучение количества больных, клетки крови которых отвечают выработкой ИФН на введение различных ИФН-содержащих препаратов или его индукторов в сравнении с ФМ. Как следует из таблицы, чувствительность больных ни к одному из известных препаратов не была равной 100%. В ответ на введение ИФН-содержащих препаратов его уровень возрастает в среднем от 16 до 40% случаев. Введение препаратов – индукторов ИФН стимулировало интерферонегенез лимфоцитов в среднем от 64% до 73%. На фоне хорошо известных препаратов в ответ на введение фитомикстур клетки крови больных вырабатывали ИФН в 100% случаев, что свидетельствует о высокой чувствительности клеток к растительным комплексам. Хотя уровень чувствительности к фитосоставам №1 и 7 был одинаков, вар. №1 проигрывает по интерфероногенному эффекту.

     
  • Влияние препаратов интерферона и его индукторов на интерфероногенез онкологических больных in vitro

  • При разработке нашего адаптогенного препарата необходимо было решить проблему поиска критерия биологического контроля и стандартизации растительного комплекса. Для этого мы использовали ранее разработанный нами способ определения адаптогенной активности по уровню пролиферации медленно растущих дрожжевых культур Saccharomyces сerevisiae. Наиболее активный рост наблюдался (индекс пролиферации - 4,86) при культивировании клеток дрожжей в полной среде с глюкозой, когда ассимиляция углерода происходит по наиболее эффективному пути аэробного гликолиза. Замена в среде глюкозы на этанол как менее предпочтительный источник углеродного питания приводила к замедлению роста клеток (индекс пролиферации - 1,86). Добавление в среду инкубации различных доз адаптогенов увеличивало темпы клеточного роста.

    Для отдельных адаптогенов было показано, что зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания БАВ препарата (суммарной гликозидной фракции для женьшеня и фенольных соединений для родиолы розовой) является индивидуальной характеристикой растительного адаптогена и представляет собой обратную параболу, описываемую уравнением, представленным на слайде. Коэффициент b при этом является индивидуальным для каждого адаптогена.

    Функциональная зависимость индекса пролиферации дрожжевой культуры от содержания фитопрепарата в среде культивирования

    Ip= 1,86 + b√C

     

    Ip – значение индекса пролиферации клеток

    С – содержание препарата в среде культивирования

    1,86 – значение индекса пролиферации в отрицательном контроле

  • Аналогичные исследования были проведены для отобранных комплексных составов. Показано, что функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания препарата ФМ №1 в среде в интервале исследованных доз является обратной параболой и описывается уравнением с индивидуальным коэффициентом при радикале равным 1.

    Функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей S. cerevisiae от содержания фитомикстуры № 1 в среде инкубации

  • Аналогичная зависимость получена для ФМ №7 с коэффициентом b равным 1,1. Сравнивая результаты опытов по двум фитокомпозициям, отметим, что меньший коэффициент при радикале кривой фитомикстуры №1 свидетельствует о меньшей активности последней в отношении влияния на пролиферацию дрожжевых клеток.


    Функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей S. cerevisiae от содержания фитомикстуры №7 в среде на 4-ый час культивирования

  • Коэффициент b при радикале является индивидуальным, а данные кривые - характеристическими для каждого комплекса, как и в случае с отдельными адаптогенами. Следовательно, в нашем случае возможно идентифицировать фитокомпозицию по характеру соответствующей функциональной зависимости и величине коэффициента при радикале, что может служить критерием стандартизации фитокомпозиций.

     
  • Эта величина найдена для исследуемых фитокомпозиций. Отметим, что активность фитокомпозиций превышает активность монопрепаратов. Сравнение фитосоставов между собой показало, что и по этому параметру вариант №7 превосходит вариант №1.

    Сравнение относительной адаптогенной активности монопрепаратов и комплексных фитомикстур

  • Следовательно, в данной работе на основании изучения влияния препарата на пролиферативную активность опухолевых клеток человека, влияния на иммунологический фенотип и интерфероногенную активность лимфоцитов онкологических больных и сравнения адаптогенной активности была выбрана и стандартизована фитокомпозиция №7 в качестве наиболее перспективной для дальнейших исследований. Таким образом, в работе определена система иммунобиологических тестов для скрининга адаптогенных препаратов, нацеленных на применение в качестве неспецифических иммуномодуляторов в онкологии.